能够特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其应用
2019-11-22

能够特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其应用

本申请涉及能够特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其应用。本发明人成功地生产了仅特异识别作为生理性分子的可溶性Aβ寡聚体而不识别可溶性Aβ单体的单克隆抗体。发现该抗体可以用作针对阿尔茨海默氏病诊断/治疗的单克隆抗体。

本申请是申请日为2009年2月6日、申请号为200980111237.4(PCT原申请号:PCT/JP2009/052039),发明名称为"能够特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其应用"的专利申请的分案申请。

进一步,4F7、4H5、5A5、5A9、6E4和6H4抗体的中和Aβ诱导性神经毒性的活性通过下述方法评价。首先,将人类神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)在24孔板上含10%FBS的DMEM中,以150000细胞/孔的密度培育24小时。然后,将该培养基替换为不含血清、含Aβ1-42(12.5μM)、且添加或未添加抗体的培养基,并将所述细胞再培养24小时。为确定由Αβ1-42诱导的细胞毒性,利用CytoTox96试剂盒(Promega)测定释放到所述培养基中的源自死细胞的LDH的水平。

本发明人获取的数据也是支持Αβ在人脑中展示体内神经毒性这一观点的第一个证据。众所周知人类内嗅皮层为易受AD影响的区域。在此区域内,NFT形成与神经细胞丧失发生于老年斑形成之前。因此,内嗅皮层是被普遍接受的淀粉样蛋白级联假说无法适用的一个例外区域。然而该矛盾长期以来受人忽略,无人研宄。

Description

对BALB/c小鼠通过将如上所述方法制备的抗原注射入其足垫进行免疫接种。然后,进行六次的加强免疫接种。使用小鼠蹊部淋巴结,通过使用聚乙二醇1500与Sp/0-Agl4细胞融合来产生杂交瘤。

导致体内神经毒性的Aβ多聚体(可溶性1Α9与2C3免疫反应性十二聚体)在脑实质中被发现。据此,本发明人推测,CSF亦含有所述多聚体。为证实这一点,本发明人将自十个AD患者与作为对照的十个年龄匹配的健康个体汇集的CSF通过SEC进行分级分离,并通过Aβ寡聚体特异性夹心ELISA对这些级分进行分析,其中在捕获与检测系统中使用单克隆BC05或ΒΑ27。BC05/BC05寡聚体ELISA在级分13中检测出可溶性Αβ1-42,而ΒΑ27/BA27ELISA在级分7-14中检测出可溶性Αβ1-40(数据未显示)。然而,在每个ELISA中,吸光度(450nm处的0.D.)过低以致无法敏感地检出CSF中的少量Aβ寡聚体。在相同级分中通过BNT77ELISA检测出Αβ单体,显示结合有脂蛋白的Αβ单体(级分7到14)与无脂蛋白的Αβ单体(级分15到17)在所述级分中与Αβ寡聚体共存(图7-1Α与7-1Β)(MatsubaraE,etal·,NeurobiolAging,25:833-841,2004)。在AD中结合有脂蛋白的Αβ单体的水平与健康对照相似,而在AD中无脂蛋白的Aβ-40单体(图7-1Α)与Aβ42单体(图7-1Β)较之年龄匹配的健康对照为低。本发明人亦发现在将ELISA设计为使用HRP标记的BC05或ΒΑ27作为捕获抗体时,除所述寡聚体外,与脂蛋白结合的Aβ单体可被检出。该问题在现有技术文献中未被注意(LeeEB,etal·,JBiolChem,281:4292-4299,2006),后者描述了与本文所述方法相似的分析方法(例如,6E10/6E10ELISA)。因为所述寡聚体和与脂蛋白结合的Αβ单体在SEC中洗脱的保留时间相似,无法利用与在捕获与检测中使用的抗体相同的抗体通过寡聚体ELISA对它们进行区分。从而可知,在使用Aβ寡聚体-非选择性抗体分析Aβ寡聚体时,含脂蛋白的CSF不适于用作测试试样。

技术领域

(14)一种抗体,其包含具有SEQIDNO:55的氨基酸序列作为CDR1,SEQIDNO:57的氨基酸序列作为⑶R2,和SEQIDNO:59的氨基酸序列作为⑶R3的L链;

本发明人显示本发明抗体对于预防阿尔茨海默氏病是有效的。亦即,本发明提供了阻抑阿尔茨海默氏病进展的方法,其中所述方法包括对患有阿尔茨海默氏病的个体施用包含上述本发明的抗体和药学上可接受载体的组合物的步骤。

建立准确的发病前诊断以识别具有罹患AD高风险的病例对涉及预防/治疗策略而言非常重要。本文所报道的在AD中CSF中0/M比例的显著增加,期望其为发病前诊断标志的有力候选。

到中任一项所述的抗体或的组合物,用于阻抑老年斑形成;

(3)仅识别Aβ寡聚体的特异性;

4H5:L链为κ,H链为IgG2a;

由于嵌合抗体或人源化抗体在人体内的抗原性降低,这样的抗体可用于为治疗等目的施用于人类。

(1)一种抗体,其包含具有SEQIDNO:9的氨基酸序列作为CDR1,SEQIDNO:11的氨基酸序列作为⑶R2,以及SEQIDNO:13的氨基酸序列作为⑶R3的H链;